Resumo do Projeto

Por quase sessenta anos, ascídias coloniais (principalmente Botryllus schlosseri) têm sido usadas como modelos de laboratório para o estudo do origem dos cordados, incluindo a evolução do sistema imune e aloreconhecimento, bem como diferentes aspectos da biologia animal colonial, incluindo reprodução assexuada, brotamento (i.e. blastogénese), regeneração, ou transmissão e parasitismo de células tronco somáticas e germinativas adultas. Apesar da vasta quantidade de pesquisas sobre biologia do desenvolvimento em B. schlosseri, os protocolos para transgênese e mutagênese têm dificultado os estudos de regulação e função genica. As ascídias coloniais têm fertilização interna e criam seus embriões impedindo o fácil acesso aos ovos ou ao embrião de 1 célula para eletroporação e microinjeção. Para esta proposta, planejo gerar um protocolo para transgênese em ascídias coloniais por: (i) microinjeção da construção gênica diretamente em ovos da colônia ou embriões de 1 célula, e (ii) eletroporação de células-tronco germinativas circulatórias em extratos celulares de colônias; e planejo gerar linhas mutantes de ascídias coloniais por: (iii) uma triagem mutante de autofecundação, (iv) uma forward genetic screen baseada em ENU ou radiação, ou (iv) CRISPR para nocautes direcionados de genes. Pesquisas futuras e novas descobertas em biologia do desenvolvimento usando ascídias coloniais serão diretamente beneficiadas pelos avanços técnicos delineados nesta proposta. Para nosso conhecimento, esta é a primeira tentativa de gerar linhas transgênicas e mutantes estáveis para qualquer animal colonial, e o laboratório Tiozzo está atualmente na vanguarda do desenvolvimento dessas ferramentas.